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Modelli in vitro

Le mutazioni nonsenso legate ai codoni di stop prematuri nelle linee cellulari corrette con 16HBEo- presentano una sensibilità diversa al sistema di degradazione dell'mRNA

Le linee di espressione di cellule eterologhe sono di interesse limitato, poiché non contengono introni e, nel contesto dello studio delle mutazioni nonsenso legate a difetti di codoni di stop prematuri (PTC), non consentono di studiare il sistema NMD che degrada gli mRNA portatori di questi PTC.

La linea cellulare stabilita da D Gruenert, 16HBE14o- è stata immortalata da SV40 ed è sensibile al sistema NMD. Questo ha consentito di generare, tramite CRISPR/Cas9, diverse linee omozigoti per G542X, W1282X, Y122X, R553X, R1162X, G551D, N1303K, e F508Del in un contesto V470 o M470. Per le mutazioni nonsenso, questi modelli rendono possibile testare il livello del sistema di degradazione degli mRNA nello stato basale. Ciò ha consentito di verificare che il livello di trascrizione è ridotto a 3 mutazioni: G542X, W2283X e Y122X, come previsto. Queste linee consentono anche una valutazione farmacologica differenziale dell'inibizione del NMD da parte del SMG1, un potente inibitore del NMD, e della translettura grazie al G418. L'inibizione del NMD è testata dal livello di mRNA corretto e la translettura ripristinando l'attività del CFTR nella camera di Ussing. Ad esempio, la mutazione W1282X è molto sensibile al sistema NMD, ma risponde poco al G418, a differenza della mutazione Y122X.

Queste osservazioni mostrano che il contesto del PTC incide sulla translettura e illustra la rilevanza di queste linee cellulari.

Référence

CONGRES NACFC 2018 - Venerdì 19 ottobre 2018
In vitro models of CF
W16.4 – Abstract 164 - CFTR PTC variants expressed in gene edited 16HBE14O-cel lines show differential sensitivity to nonsense mediated decay

Speaker : HC Valley

Rédacteur

Pr Isabelle Sermet-Gaudelus

Hôpital Necker, Paris, France

Service de Pneumologie et Allergologie Pédiatriques
Centre de Ressources et de Compétence de la Mucoviscidose
Institut Necker Enfants Malades/INSERM U1151
Hôpital Necker Enfants Malades, 149 rue de Sèvres, Paris 75743